结直肠癌组织中受体酪氨酸激酶EphB3的表达下调分子机制和临床意义研究(硕士

结直肠癌组织中受体酪氨酸激酶EphB3的表达下调分子机制和临床意义研究(硕士)(论文25000字)
中文摘要
研究背景：产促红细胞生成素肝细胞癌受体(Erythropoietin-producing human hepatocellular carcinoma,Eph)基因是至今为止人类最大的受体酪氨酸激酶亚家族，其在人体正常生长发育，特别是神经脉管系统发育中发挥重要作用。同时，在人类多种疾病包括某些恶性肿瘤的发生、发展和预后中也具有重要作用。Eph基因包括至少8种配体(ephrin)和14种受体（Eph），配体和受体都分别包含A和B两类。与其他酪氨酸激酶受体一样，细胞膜上Eph受体蛋白和邻近细胞膜上的ephrin配体结合，引发一系列细胞信号传导作用，导致细胞内的酪氨酸激酶磷酸化，并进一步激化下游多种蛋白分子，发挥正常生理或病理作用。虽然，已经有少量关于EphB3受体在结直肠癌（colorectal cancer, CRC）细胞中的表达研究，他们的研究发现与正常的肠道上皮细胞相比，EphB3在结肠直肠癌细胞中表达水平降低。但至今为止，EphB3在CRC的表达和临床病理参数之间的关系还不清楚。
研究方法：首先，从上海细胞库等购买了肠癌细胞系HCT116、HT29、SW480和SW620进行细胞培养，利用细胞免疫组化染色和Western blot对肠癌细胞系的EphB3蛋白表达进行了检测。接着，从医院病理科档案室选取了128个经过病理检查证实的结直肠癌的石蜡固定组织标本和19个肠腺瘤标本，并收集其临床病理资料，以及电话随访患者生存信息。购买了针对EphB3受体的特异性抗体，使用免疫组织化学染色方法检查了这组标本中EphB3蛋白的表达。当发现与同一患者正常肠黏膜细胞比较，EphB3在肿瘤细胞中表达下调的现象后，采用甲基化特异性PCR（MSP）分析了肠癌细胞系中EphB3启动子区甲基化状态。由于微卫星不稳定性(MSI)、KRAS基因突变和BRAF基因突变在结直肠癌发生、进展和治疗中具有重要作用，因此，应用现代分子生物学技术分析了这组标本中的MSI状态，KRAS和BRAF突变情况，并分析了它们与EphB3表达的相关性。最后，用Sperman等级相关性和Kaplan–Meier生存分析方法分别对EphB3表达与临床病理参数和患者生存情况之间的相关性进行了统计学分析。
实验结果：检测的128例结直肠癌组织样本中，EphB3蛋白在正常肠粘膜上皮细胞（128/128）和腺瘤细胞（19/19）中都强阳性表达。在CRC的肿瘤细胞中， EphB3的表达表现为多种形式，其中阴性或弱阳性表达为41.4%（53/128），中度阳性表达为26.6%（34/128），强阳性表达为32.0%（41/128）。统计学分析发现EphB3表达与肿瘤侵犯深度 (P =0.016,rs =−0.213),淋巴结转移(P = 0.000,rs =−0.490),和TNM分级(P = 0.000,rs =−0.390) 呈负相关；与分化程度 (P = 0.001,rs =0.290),BRAF V600E突变（P =0.008, rs =0.235）和总生存期(P< 0.001)呈正相关。在多变量分析发现，EphB3表达（P=0.007）和淋巴结转移（P<0.001）为患者生存时间的独立预后因子。在肠癌细胞株和部分CRC组织中检测到EphB3启动子区的超甲基化。因此，推断在CRC中与正常的粘膜相比，EphB3在肠癌组织中表达下调，CpG岛的超甲基化可能是CRC EphB3下调的重要分子调控机制。
研究结论：在结直肠癌中，甲基化导致EphB3的表达下调，EphB3蛋白可能是一个潜在的预后指标。

Abstract
Although EphB3 expression is down-regulated in colorectal cancer (CRC) cells compared with normal intestinal epithelial cells,the relationship between EphB3 expression and clinicopathological parameters in CRC is unclear.We examined EphB3 expression in 128 CRC tissue specimens and in 19 adenoma specimensusing immunohistochemistry. The relationships between EphB3 expression and clinicopathological parameters, KRAS mutations, BRAF V600E mutation, MSIand survival wereevaluated using Spearman’s rankcorrelation and Kaplan–Meier survival analyses, respectively.CpG methylation in the EphB3 promoter was examined in four human CRC cell lines and tissues. EphB3 was strongly expressedin all normal intestinal epithelial cells (128/128) and adenoma cells (19/19). In CRC tumor cells, EphB3expression was negative or weak in 41.4% (53/128), moderate in 26.6% (34/128), and strong in 32.0% (41/128) of samples. EphB3 expression was negatively associated with invasive depth (P = 0.016, rs = −0.213), lymph node metastasis (P = 0.000, rs = −0.490), and TNM stage (P = 0.000, rs = −0.390),and waspositively associated with poor differentiation(P = 0.001, rs = 0.290),BRAF V600E mutation (P = 0.008, rs = 0.235), and longer overall survival (P < 0.001). In multivariate analysis, EphB3 expression (P = 0.007) and lymph node metastasis (P < 0.001) were independent prognostic factors for poor survival. Hypermethylation of the EphB3 promoter was detected in cell lines and CRC tissues. EphB3 is down-regulated in CRC compared to normal mucosa. Hypermethylation of CpG island is contributed to downregulation of EphB3 in CRC. EphB3 expression in tumor cells may be a useful prognosticindicator for patients with CRC.

目录
正文    6
一、 实验材料、试剂和实验设备    6
1. 大肠癌细胞系、细胞培养试剂、设备    6
2. 结直肠癌组织标本石蜡固定和病理切片设备    7
3. 抗体和免疫组化设备    7
4. Western blot    7
5. 甲基化检测试剂和设备    7
6. 微卫星不稳定性检测试剂盒和设备    8
7. KRAS突变检测试剂盒和设备    8
8. BRAF突变检测试剂盒和设备    8
二、 实验方法    8
1. 细胞培养    8
2. 细胞免疫化学染色    8
3. Western blot    8
RIPA裂解液配制    8
150 mM NaCl    8
细胞总蛋白提取    9
制备双层PAGE胶    9
A/下层胶    9
B/上层胶(stack gel 5%)    9
上样    10
转膜    10
抗体反应及显色    10
三、 实验结果    16
1. 大肠癌细胞EphB3表达    16
2. 肠癌细胞EphB3基因CpG岛甲基化    18
3. 结直肠癌组织中EphB3表达    18
4. 结直肠癌组织EphB3表达的临床意义    19
5. 结直肠癌组织MSI状态及EphB3表达与MSI相关性分析    20
6. 结直肠癌组织EphB3表达与KRAS突变相关性分析    21
7. 结直肠癌组织EphB3表达与BRAF突变相关性分析    21
8. 结直肠癌组织EphB3表达与患者生存时间的相关性    22
四、讨论    23
五、结论    25
六、参考文献：    25